好不容易设计的课题，却卡在模型构建上？配繁不生、鉴定不准、策略复杂……这些坑你是不是也正在经历？别急，这篇避坑指南+宝藏手册能帮你破局！

基因工程小鼠模型已成为现代生命科学研究的核心工具，尤其在解析基因功能、疾病机制和药物验证中不可或缺。而条件性敲除/敲入（CKO/CKI）模型，凭借其“时空特异性”操控基因的能力，更是成为了组织特异性研究的不二之选。

• 组织特异性——精准在肝、脑等靶器官中敲除致病基因，避免全身性敲除带来的发育致死。

•  时间可控性——通过他莫昔芬（Tamoxifen）等诱导剂控制Cre酶活性，实现在特定时间点敲除基因。

然而，从策略设计到最终获得可靠模型，一路可谓坑坑洼洼。想要顺利通关，必须攻克以下三大难点！

难点1：繁育策略设计——多基因交配的“迷宫困局”

第一步繁育策略就让人头大，以CKO/CKI模型为例，通常配繁策略需从配繁周期、目标子代获取比例、对照获取情况等多角度考虑。传统的“先获得flox纯合，再与Cre鼠交配”策略，不仅耗时漫长，还需额外建立对照组，费时费鼠。

高效策略推荐：同步配繁，事半功倍~

难点2：繁育效率黑洞——母鼠不生、吃仔、弃养连环暴击

策略对了，生不出来也是白搭。繁育环节的“黑天鹅”事件，分分钟让科研人崩溃。

不生？——可能是“婚配”方式不对

首先确保小鼠处于最佳育龄，一般雌鼠6周龄、雄鼠8周龄性成熟，超过6月龄生殖能力开始下降，若出现不孕不育现象，建议优先确认繁殖笼小鼠的周龄和健康状态。通常按每笼1雄配2雌进行繁殖笼配置，若长期未见生仔（1~1.5个月）可以尝试将各笼雄雌鼠互换，或者雄鼠单放休息几天后再合笼。一般来说,至少需要2~4 对育龄小鼠进行繁育。若特殊品系有生育缺陷表型或需要加快繁育速度,可以扩大繁殖笼数量。

吃仔弃养？——环境与操作是关键

母鼠初次产仔，或笼盒内外环境异常时均有可能增加食仔或不带仔的概率。此外，人为的干扰（如沾到消毒剂、频繁抓取）等原因，均有可能导致小仔携带“异味”，从而出现弃养现象。因此，在确保带仔小鼠饲养环境适宜的情况下，需尽量减少对小鼠的操作，并及时观察笼盒内母鼠及小仔情况，若发现食仔或不带仔情况，也可考虑用相近时期合笼且母性较好的品系进行代乳操作。（操作建议详见文末手册）

难点3：鉴定准确性崩塌——结果不可重复的元凶

千辛万苦等到小鼠出生，基因型鉴定结果却一团糟？假阳性和假阴性是拖慢进度的终极杀手。

在鉴定时加入阳性对照、阴性对照及空白对照，能够更好判断鉴定结果是否准确，而若对照结果异常，则提示鉴定结果存在偏差。

假阳性（空白对照出现条带）？——警惕“气溶胶污染”

若实验结果出现假阳性，除排查试剂或耗材污染，还需警惕气溶胶污染风险。此类污染是PCR实验室的噩梦——极微量核酸气溶胶即可导致结果异常，且具顽固性。若已存在气溶胶污染，可通过优化程序：提高退火温度并减少3–5个循环，或者更换扩增区域（建议片段≤800bp） 尝试规避。当然，保持洁净实验室环境与规范操作，才是杜绝此类问题发生的根本途径。

假阴性（阳性对照没条带）？——模板/引物/程序是重点

PCR扩增效率与模板质量、酶、引物、反应程序均密切相关，需从四个方向逐一排查。但值得注意的是，某些实验结果可能具备一定的迷惑性，例如：某案例使用两对引物进行扩增，其中200bp条带扩增成功，而800bp未扩增出条带，而优化模版质量后，问题得到解决。因此，核酸模版的质控与保存也至关重要。

• 浓度与纯度：推荐使用浓度为20-80 ng/μl，A260/A280比值在1.8-2.0之间的DNA模板。

• DNA保存条件：推荐TE溶解，短期（≤2周）可保存于4℃中，长期保存应置于-20℃中，且避免反复冻融。

更多模型建系策略、饲养繁育经验、基因鉴定技巧等硬核干货已为你整理成册~

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