小鼠基因型鉴定是基因工程小鼠相关研究的核心基础环节，直接影响实验分组准确性与研究数据可靠性。科研人员在实操中常面临条带异常、判读误差、扩增失败等问题，如纯合子结果呈现杂合子特征等。本文严格基于实验实操经验，梳理鉴定核心流程与关键要点，为科研人员提供标准化参考。

一、PCR 基本原理与核心要素

小鼠基因型鉴定以 PCR 技术为核心，通过模拟 DNA 天然复制过程，经变性、退火、延伸三步循环实现目标基因片段的特异性扩增。成功完成鉴定需把控四大关键要素：

1. 高质量 DNA 模板：无污染、无降解，为扩增提供稳定基础；

2. 特异性引物：精准匹配目标基因序列，减少非特异性结合；

3. 适配的 PCR 程序：温度与循环参数匹配引物及片段特性；

4. 高效扩增酶：保障 DNA 链合成的稳定性与扩增效率。

二、DNA 模板质量控制规范

DNA 模板的纯度与完整性直接决定扩增效果，推荐采用 “蛋白酶 K 消化 + 纯化柱法” 制备，核心要求如下：

1. 消化流程：37℃温育 30 分钟，确保组织样本充分消化；

2. 纯化步骤：严格执行 “上样→洗涤→洗脱” 流程，彻底去除蛋白质、有机溶剂及盐类杂质；

3. 质量标准：DNA 浓度控制在 20-100 ng/μL，A260/280 比值需在 1.8-2.0 之间；

4. 保存与操作：避免高温长期存放及反复冻融，防止 DNA 降解；离心时需对称平衡，全程使用无酶枪头，规避交叉污染。

三、引物设计与优化策略

1. 设计核心：针对目标基因片段精准设计，规避非特异性结合位点；

2. 问题应对：同一模板中部分基因扩增异常时，优先重新设计引物，同步核查并提升模板质量；

3. 温度适配：引物特异性与退火温度密切相关，需根据实际情况优化调整。

四、PCR 程序设置要点

1. 常规程序：采用变性 - 退火 - 延伸三步法，依据引物特性与片段长度设定各步骤时长；

2. 特异性优化：针对复杂片段可采用梯度降温程序（Touch down, TD），前 20 个循环中退火温度从 65℃每循环递减 0.5℃至 55℃，通过较高温度优先富集目的产物，减少非特异性扩增。

五、扩增酶选择原则

优先选用组分简单、扩增效率高、批次稳定性强的 DNA 聚合酶。避免使用辅助成分过多的酶制剂，防止其与模板中微量杂质发生相互作用，影响扩增效果。

六、常见问题与解决方案

实验过程中常会遇到多种问题：泳道弥散可能源于凝胶浓度不当；空白对照出现目的带提示存在污染；即使加倍DNA模板仍无扩增时，需系统检查引物设计、程序参数和酶活性等因素。这些问题都需要通过方法优化和严格的操作规范来解决。

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