双特异性T细胞衔接器（T-Cell Engager，TCE）是一类创新性双特异性抗体药物，能够同时靶向肿瘤细胞表面抗原和T细胞表面CD3受体，通过重定向T细胞特异性识别并杀伤肿瘤细胞，从而实现抗肿瘤治疗效果。体外筛选是TCE药物开发流程中的关键环节，旨在从大量候选分子中高效识别出具有高活性、低毒性的先导化合物。TCE药物的体外评价主要核心指标：靶点结合亲和力，肿瘤细胞特异性杀伤，T细胞激活与增值效应以及细胞因子释放特征等。

2024年5月，FDA加速批准了靶向DLL3和CD3的双特异性T细胞衔接器Tarlatamab用于治疗广泛期小细胞肺癌（ES-SCLC）成人患者。本文以Tarlatamab为例，系统展示其临床前体外药效学评价结果。

图1. TCE药物的作用机制^[2]

案例研究一: DLL3肿瘤细胞系筛选与表面抗原定量分析

目的：采用流式细胞术检测8株小细胞肺癌（SCLC）细胞系的DLL3表面表达（阳性率及抗原量），筛选适宜细胞模型，为后续活性评估提供依据。

结果：检测显示多数SCLC细胞系均表达DLL3，其中SHP-77细胞系的表达水平最高。

图2. 8种小细胞肺癌(SCLC)细胞系中DLL3蛋白表达水平

表1. 8种小细胞肺癌(SCLC)细胞系表面DLL3表达水平

案例研究二: 细胞结合实验

目的：通过流式细胞术评估Tarlatamab与T细胞（Jurkat、PBMCs）CD3及SCLC细胞DLL3的结合特性。

结果：Tarlatamab对DLL3表现出高亲和力结合，而对CD3的结合能力相对较弱 。

图3. CD3（左）与DLL3（右）的细胞水平亲和力分析

案例研究三: T细胞活化报告基因实验（NFAT-Luc Jurkat 细胞模型）

目的：将Jurkat-NFAT-Luc细胞与SHP-77共培养，经Tarlatamab处理5小时后检测荧光素酶活性，评估T细胞活化程度。

结果：Tarlatamab在肿瘤共培养体系中可显著激活NFAT信号通路。为 TCE 药物活性评价提供了快速高效的筛选平台。

图4. NFAT-Luc Jurkat细胞激活的荧光素酶活性检测

案例研究四: T细胞依赖性细胞毒性实验（TDCC）

目的：利用原代PBMCs和肿瘤细胞，评估肿瘤细胞杀伤效应的剂量依赖性和时间依赖性。

方法1：基于流式细胞术的TDCC实验

将PBMCs与CFSE标记的肿瘤细胞按5:1的效靶比共培养48小时，SYTOX-AAD染色后通过流式细胞术定量肿瘤细胞杀伤率。

结果：Tarlatamab可有效介导PBMCs杀伤SCLC细胞系，包括DLL3低表达细胞系，且细胞毒性与作用时间呈正相关。

图5. AMG 757针对典型SCLC细胞系的时间-剂量效应曲线

方法2: 基于荧光素酶报告基因细胞系的活性检测

目的：将PBMCs与表达荧光素酶的肿瘤细胞按5:1的效靶比共培养48小时，检测发光值（RLU）并计算相对于对照组的肿瘤细胞杀伤率。

结果：Tarlatamab可显著介导PBMCs杀伤NCI-H82-Luc细胞系，其细胞毒性与作用时间呈正相关。

图6. Tarlatamab针对NCI-H82-Luc细胞系的时间-剂量效应曲线

案例研究五: TDCC 中的细胞因子释放分析

目的：采用流式细胞微球阵列（CBA）技术检测TDCC上清液中细胞因子水平。

结果：在肿瘤细胞与PBMCs共培养体系中，Tarlatamab诱导了多种细胞因子呈剂量依赖性释放，其中IFN-γ在48小时达到顶峰后逐渐下降。

图7. 肿瘤细胞与PBMCs共培养体系中的剂量依赖性细胞因子释放

案例研究六: TDCC中的T细胞活化分析

目的：通过检测CD69、CD25、CD71、CD137、PD-1及PD-L1表达水平，评估T细胞活化状态。

结果：Tarlatamab可显著诱导CD4⁺和CD8⁺T细胞表达活化标志物，同时上调PD-1/PD-L1表达，为联合PD-1/PD-L1 抑制剂治疗提供了理论依据。时间梯度实验显示T细胞活化标志物呈现动态表达模式。

图8. Tarlatamab处理后CD4+与CD8+T细胞的生物标志物表达

案例研究七: T细胞增殖实验

目的：评估Tarlatamab在不同DLL3表达水平的肿瘤细胞共培养体系中对 T细胞增殖的影响

结果：Tarlatamab以DLL3依赖性方式显著促进T细胞增殖。

图9. Tarlatamab促进T细胞增殖

案例研究八: 旁观者效应评估

目的：评估Tarlatamab是否可诱导T细胞介导的对邻近DLL3阴性肿瘤细胞的清除。NCI-H446细胞经工程化改造以表达荧光素酶，通过检测荧光素酶（Luc）分析对NCI-H446细胞的杀伤情况。 

结果：在SHP-77存在的情况下，Tarlatamab可诱导对NCI-H446细胞的杀伤，与剂量和共孵育时间呈正相关。这种效应可能与T细胞活化增强或细胞因子介导的杀伤作用相关。

图10. Tarlatamab诱导抗原阴性肿瘤细胞的杀伤

集萃药康（GemPharmatech）建立了完善的TCE药物体外评价平台，可系统开展抗原表达谱分析、结合亲和力测定，免疫细胞激活及肿瘤细胞杀伤等全方位评估，为TCE候选药物的筛选与优化提供强有力的技术支持，提升临床前研究成功率。